{"id":449,"date":"2021-12-22T19:45:32","date_gmt":"2021-12-22T19:45:32","guid":{"rendered":"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/?p=449"},"modified":"2022-02-08T20:23:23","modified_gmt":"2022-02-08T20:23:23","slug":"clase-digital-16-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/clase-digital-16-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa\/","title":{"rendered":"Clase digital 16. Reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa"},"content":{"rendered":"\n\n\n<div class=\"wp-block-cover is-light\" style=\"min-height:284px;aspect-ratio:unset;\"><span aria-hidden=\"true\" class=\"has-background-dim-40 wp-block-cover__gradient-background has-background-dim\"><\/span><img decoding=\"async\" class=\"wp-block-cover__image-background wp-image-450\" alt=\"\" src=\"data:image\/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP\/\/\/yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7\" data-src=\"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-scaled.jpg\" style=\"object-position:73% 17%\" data-object-fit=\"cover\" data-object-position=\"73% 17%\" \/><noscript><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1707\" height=\"2560\" class=\"wp-block-cover__image-background wp-image-450\" alt=\"\" src=\"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-scaled.jpg\" style=\"object-position:73% 17%\" data-object-fit=\"cover\" data-object-position=\"73% 17%\" srcset=\"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-scaled.jpg 1707w, https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-200x300.jpg 200w, https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-683x1024.jpg 683w, https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-768x1152.jpg 768w, https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-1024x1536.jpg 1024w, https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/pexels-karolina-grabowska-4226922-1365x2048.jpg 1365w\" sizes=\"auto, (max-width: 1707px) 100vw, 1707px\" \/><\/noscript><div class=\"wp-block-cover__inner-container is-layout-flow wp-block-cover-is-layout-flow\">\n<p class=\"has-text-align-center has-base-3-color has-text-color has-large-font-size wp-block-paragraph\">Reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa<\/p>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\" id=\"introduccion\">Introducci\u00f3n<\/h2>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">\u00a1Hola!<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Es muy grato tenerte como estudiante en esta Unidad de Aprendizaje, para mi es un gran honor encontrarme con personas tan disciplinadas y comprometidas con su educaci\u00f3n como lo eres t\u00fa \u00a1Te felicito!<br>Volviendo al tema de las clases, te invito a proseguir con esta nueva sesi\u00f3n n\u00famero 16 titulada Reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa de la UDA de Biolog\u00eda Molecular.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En esta clase veremos una de las t\u00e9cnicas m\u00e1s utilizadas en el laboratorio de Biolog\u00eda Molecular. Se trata de la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR). Esta t\u00e9cnica sirve para amplificar fragmentos de ADN y es una de las t\u00e9cnicas de rutina en el laboratorio. Adem\u00e1s, es la que posee una gran cantidad de aplicaciones y su uso se ha incrementado considerablemente, debido a esto es de importancia conocer sus fundamentos. Tambi\u00e9n se abordar\u00e1n dos t\u00e9cnicas basadas en la PCR. Es importante que pongas especial atenci\u00f3n a los conceptos te\u00f3ricos presentados ya que te ser\u00e1n de utilidad en la siguiente sesi\u00f3n pr\u00e1ctica.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En este contexto, \u00a1Comencemos nuestra clase!<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\" id=\"desarrollo-del-tema\">Desarrollo del tema<\/h2>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\" id=\"reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-pcr\">Reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR)<\/h3>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingl\u00e9s Polymerase Chain Reaction) es, la t\u00e9cnica m\u00e1s importante y revolucionaria en biolog\u00eda molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una sola mol\u00e9cula. Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary Mullis debido a la necesidad de obtener, de manera r\u00e1pida y econ\u00f3mica, un gran n\u00famero de copias de fragmentos espec\u00edficos de ADN. La amplificaci\u00f3n se basa en el mecanismo de replicaci\u00f3n del ADN que lleva a cabo la c\u00e9lula, por lo que se requiere de una cadena que sirva como molde y a partir de ella por complementariedad se van adicionando cada uno de los nucle\u00f3tidos. La direcci\u00f3n en la que se lleva a cabo es la misma que durante la replicaci\u00f3n de 5&#8242; a 3&#8242;, ya que tambi\u00e9n requiere de un nucle\u00f3tido con el grupo OH libre en el extremo 3&#8242;.<\/p>\n\n\n\n<div class=\"wp-block-image\"><figure class=\"aligncenter size-full is-resized\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"data:image\/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP\/\/\/yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7\" data-src=\"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/UDA_BiologiaMolecular_Imagen82.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-452\" width=\"640\" height=\"440\" \/><noscript><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" src=\"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/wp-content\/uploads\/sites\/71\/2021\/11\/UDA_BiologiaMolecular_Imagen82.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-452\" width=\"640\" height=\"440\" \/><\/noscript><figcaption>Imagen 1. La reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una sola mol\u00e9cula.<\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Los componentes de una reacci\u00f3n de PCR son los siguientes:<\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\"><li><strong>ADN polimerasa<\/strong>. Es la que lleva a cabo la reacci\u00f3n de polimerizaci\u00f3n de la cadena de ADN, de forma similar a los que sucede durante el proceso de replicaci\u00f3n del ADN. La que m\u00e1s se utiliza es la Taq polimerasa aislada de la bacteria Thermophilus aquaticus. Esta enzima es termoestable, incluso a temperaturas de 95\u00b0C.<\/li><li><strong>Magnesio<\/strong>. Requerido por la enzima para funcionar. Act\u00faa como cofactor de la polimerasa.<\/li><li><strong>Oligonucle\u00f3tidos<\/strong>. Es uno de los componentes m\u00e1s importantes de la reacci\u00f3n. Influyen en la eficiencia y especificidad de la reacci\u00f3n de amplificaci\u00f3n. Se dise\u00f1a un oligo sentido y uno antisentido, y se dise\u00f1an de tal forma que flanqueen la secuencia a amplificar. Se deben tomar en cuenta las siguientes caracter\u00edsticas al momento de dise\u00f1arlos:<ul><li>Composici\u00f3n de bases: contenido de G y C debe estar entre 40 a 60%<\/li><li>Longitud: Debe de ser entre 18 a 25 nucle\u00f3tidos.<\/li><li>Evitar que existan secuencias complementarias en el oligo y que estos no sean complementarios entre s\u00ed.<\/li><li>La temperatura de alineamiento debe ser muy cercana o la misma para cada par de oligos. No debe de diferir en m\u00e1s de 5\u00b0C y se recomiendan temperaturas entre 50 a 65\u00b0C.<\/li><\/ul><\/li><li><strong>Nucle\u00f3tidos<\/strong>. Se tienen que adicionar los desoxirribonicle\u00f3tidos trifosfatados (dNTPs) ya que con ellos se van a generar los fragmentos de ADN que se quieren amplificar. Se utilizan en concentraciones equimolares de cada uno de ellos.<\/li><li><strong>ADN molde<\/strong>. Es la mol\u00e9cula de ADN de la cual se va a amplificar el fragmento o fragmentos deseados. Funciona como molde para la amplificaci\u00f3n.<\/li><\/ul>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La reacci\u00f3n se lleva a cabo en etapas y estas se repiten un determinado n\u00famero de veces. Cada repetici\u00f3n se denomina ciclo de amplificaci\u00f3n y generalmente se utilizan de 20 a 40 ciclos de amplificaci\u00f3n. En cada ciclo la secuencia de inter\u00e9s se amplifica de manera exponencial (n\u00famero de mol\u00e9culas = 2 no. de ciclos). Las etapas de la reacci\u00f3n son las siguientes:<\/p>\n\n\n\n<ol class=\"wp-block-list\"><li><strong>Desnaturalizaci\u00f3n<\/strong>. Al principio de la reacci\u00f3n se da una desnaturalizaci\u00f3n inicial la cual consiste en calentar la mezcla de reacci\u00f3n a 95\u00b0C por 10 min. Esto ocasiona que las dos cadenas del ADN molde se separen, se active la polimerasa y se desnaturalice cualquier contaminante que pudiera estar presente en la reacci\u00f3n. Una vez pasados los 10 min, se da otra etapa de desnaturalizaci\u00f3n, a la misma temperatura, pero un tiempo que va de 20 a 3o segundos.<\/li><li><strong>Alineamiento<\/strong>. Una vez terminado el tiempo de la etapa de desnaturalizaci\u00f3n, lo que sigue es la etapa de alineamiento. En esta, los oligonucle\u00f3tidos se alinean, por complementariedad de bases, a la secuencia de ADN molde y se unen a ella. La temperatura de esta etapa depende de las caracter\u00edsticas de los oligos y el tiempo oscila entre los 20 y 40 segundos.<\/li><li><strong>Extensi\u00f3n<\/strong>. Una vez unidos los oligos al ADN molde, viene la etapa de elongaci\u00f3n. Es en esta etapa en donde act\u00faa la ADN polimerasa. La enzima va adicionando cada uno de los nucle\u00f3tidos, utilizando como plantilla cada una de las cadenas del ADN molde. Los oligos proporcionan el extremo OH libre que la enzima requiere para adicionar el siguiente nucle\u00f3tido, recordando que las ADN polimerasa no pueden iniciar la s\u00edntesis desde cero. La temperatura en esta etapa es de 72\u00b0C y el tiempo va a depender de la longitud del fragmento a amplificar. Se utiliza un aproximado de 1 minuto por cada 1-1.5 kilobases. Terminado el tiempo de la etapa de elongaci\u00f3n, el ciclo se vuelve a repetir, es decir, se vuelve a llevar a cabo la etapa de desnaturalizaci\u00f3n, alineamiento y extensi\u00f3n dependiendo el n\u00famero de ciclos que se requieran. Terminada la etapa de elongaci\u00f3n del \u00faltimo ciclo, se da una segunda etapa de elongaci\u00f3n a la misma temperatura, pero por un tiempo m\u00e1s extenso. Lo anterior nos asegura que todos los fragmentos sean amplificados en su totalidad y que no queden incompletos. De esta manera termina la reacci\u00f3n.<\/li><\/ol>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Te invito a visualizar el siguiente video en donde se explica la t\u00e9cnica de PCR.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-embed is-type-video is-provider-youtube wp-block-embed-youtube wp-embed-aspect-16-9 wp-has-aspect-ratio\"><div class=\"wp-block-embed__wrapper\">\n<iframe loading=\"lazy\" title=\"How PCR (Polymerase Chain Reaction) works explained in 1 minute\" width=\"1200\" height=\"675\" src=\"https:\/\/www.youtube.com\/embed\/NODrmBHHni8?feature=oembed\" frameborder=\"0\" allow=\"accelerometer; autoplay; clipboard-write; encrypted-media; gyroscope; picture-in-picture\" allowfullscreen><\/iframe>\n<\/div><\/figure>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\" id=\"rt-pcr\">RT-PCR<\/h3>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La t\u00e9cnica de transcripci\u00f3n reversa acoplada a la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa es una de las aplicaciones de esta \u00faltima. En esta t\u00e9cnica se parte de una muestra de ARNm o ARN total y se sintetiza ADN complementario de cadena sencilla. Es decir, se lleva a cabo la reacci\u00f3n inversa de la transcripci\u00f3n. Para ello se hace uso de una enzima denominada transcriptasa reversa, la cual se aisl\u00f3 por primera vez de un retrovirus. Una vez sintetizado el ADN complementario (ADNc), este se utiliza como molde para la amplificaci\u00f3n por PCR. Esta t\u00e9cnica se utiliza para determinar la expresi\u00f3n de un gen, es decir, su transcripci\u00f3n.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Te invito a ver el siguiente video que trata sobre la t\u00e9cnica de RT-PCR<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-embed is-type-video is-provider-youtube wp-block-embed-youtube wp-embed-aspect-16-9 wp-has-aspect-ratio\"><div class=\"wp-block-embed__wrapper\">\n<iframe loading=\"lazy\" title=\"cDNA Synthesis Protocol by Reverse Transcription\" width=\"1200\" height=\"675\" src=\"https:\/\/www.youtube.com\/embed\/VT_nNVO95eI?feature=oembed\" frameborder=\"0\" allow=\"accelerometer; autoplay; clipboard-write; encrypted-media; gyroscope; picture-in-picture\" allowfullscreen><\/iframe>\n<\/div><\/figure>\n\n\n\n<h3 class=\"wp-block-heading\" id=\"pcr-en-tiempo-real\">PCR en tiempo real<\/h3>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La PCR en tiempo real es una variante de la t\u00e9cnica de PCR convencional. En esta, la amplificaci\u00f3n se monitorea en tiempo real utilizando t\u00e9cnicas de fluorescencia. Se invent\u00f3 en 1996 por Higuchi y colaboradores. En esta t\u00e9cnica lo que se detecta es la fluorescencia emitida cada vez que se sintetiza un nuevo fragmento de ADN y tiene la sensibilidad suficiente para detectar una \u00fanica mol\u00e9cula, permitiendo cuantificar el contenido de ADN en la muestra.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En la PCR tiempo real los fragmentos amplificados son peque\u00f1os y requiere que un compuesto fluorescente se una al fragmento formado y reporte su presencia. De esta manera, la se\u00f1al detectada refleja la cantidad de producto formado. Durante los ciclos iniciales la se\u00f1al es d\u00e9bil, pero conforme aumenta el n\u00famero de ciclos, la se\u00f1al se va incrementando.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Los compuestos que generan la fluorescencia son de dos tipos:<\/p>\n\n\n\n<ol class=\"wp-block-list\"><li>Sondas espec\u00edficas: como la sonda Taqman.<\/li><li>Colorantes no espec\u00edficos como el SYBR green, que solo da fluorescencia cuando se une al ADN de cadena doble.<\/li><\/ol>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En esta t\u00e9cnica la concentraci\u00f3n relativa de nuestra secuencia de inter\u00e9s se obtiene interpolando todas las muestras en un punto umbral, ciclo de corte o Ct. Este ciclo se elige de tal manera que caiga dentro de la regi\u00f3n exponencial de amplificaci\u00f3n. A menor valor de Ct existe mayor cantidad inicial de mol\u00e9culas del gen de inter\u00e9s en una muestra. Con estos valores se puede cuantificar la cantidad de ADN que ten\u00eda nuestra muestra de inter\u00e9s. Es por ello que esta t\u00e9cnica tambi\u00e9n se conoce como PCR cuantitativo o qPCR.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Las etapas son las mismas que en un PCR convencional, lo \u00fanico que cambia es el n\u00famero de ciclos de amplificaci\u00f3n, el cual es de aproximadamente 40 ciclos.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La t\u00e9cnica se puede acoplar a una reacci\u00f3n de transcripci\u00f3n reversa y utilizarse para cuantificar el nivel de expresi\u00f3n de un gen o un conjunto de genes en una muestra en particular.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\" id=\"conclusion\">Conclusi\u00f3n<\/h2>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En resumen, en esta clase se abordaron los principios y componentes de la t\u00e9cnica de PCR, la cual es una de las m\u00e1s utilizadas en el laboratorio de Biolog\u00eda Molecular. Actualmente muchos laboratorios la est\u00e1n utilizando como t\u00e9cnica de diagn\u00f3stico, sobre todo en pruebas moleculares, por lo que su uso se est\u00e1 incrementando cada vez m\u00e1s.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Hemos llegado al final de la sesi\u00f3n y me parece que vas sobre pasos muy seguros hacia el \u00e9xito. \u00a1Te felicito! No olvides la tarea asignada a esta clase, recuerda que es tu evidencia de aprendizaje, m\u00e1ndala como corresponde. Nos encontramos en la siguiente clase para poner en pr\u00e1ctica lo aprendido esta vez.<\/p>\n\n\n\n<h2 class=\"wp-block-heading\" id=\"fuentes-de-informacion\">Fuentes de informaci\u00f3n<\/h2>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\"><li>Salazar M.A.M., Sandoval R.A.S. y Almend\u00e1riz B.J.S. (2016). Biolog\u00eda Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. (2a ed.). McGraw Hill<\/li><\/ul>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Introducci\u00f3n \u00a1Hola! Es muy grato tenerte como estudiante en esta Unidad de Aprendizaje, para mi es un gran honor encontrarme con personas tan disciplinadas y comprometidas con su educaci\u00f3n como lo eres t\u00fa \u00a1Te felicito!Volviendo al tema de las clases, te invito a proseguir con esta nueva sesi\u00f3n n\u00famero 16 titulada Reacci\u00f3n en cadena de &#8230; <a title=\"Clase digital 16. Reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa\" class=\"read-more\" href=\"https:\/\/blogs.ugto.mx\/rea\/clase-digital-16-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa\/\" aria-label=\"Leer m\u00e1s sobre Clase digital 16. 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