Sesión de laboratorio. Reacción en cadena de la polimerasa
Introducción
¡Hola!
Es una alegría encontrarnos en este espacio formativo, espero que sigas gozando de buena salud y de un excelente ánimo pues te ayudarán bastante para completar esta Unidad de Aprendizaje que ya está entrando a su etapa final; te invito a tu clase 17 titulada Sesión de laboratorio: Reacción en Cadena de la Polimerasa de la UDA de Biología Molecular.
En esta ocasión veremos una de las técnicas más utilizadas en el laboratorio de Biología Molecular, se trata de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se vio en la clase teórica, esta técnica se utiliza para amplificar fragmentos de ADN y es una de las técnicas de rutina en el laboratorio. Además, es la que posee una gran cantidad de aplicaciones y su uso se ha ido incrementando considerablemente. De ahí la importancia de que se adquiera el conocimiento y la práctica necesaria para poder llevarla a cabo. En esta práctica las condiciones de amplificación que se utilizan pueden ser variables, esto va a depender de los oligos que se tengan disponibles, así como del tipo de muestra con la que se cuente en el laboratorio. Es por eso que en el procedimiento se manejarán condiciones estándar o incluso se hará la indicación de que temperatura emplear.
Bueno, pues adelante ¡Comencemos la clase!
Desarrollo del tema
Procedimiento:
- Se ponen a descongelar todos los reactivos en hielo, incluida la muestra.
- Se prepara la mezcla de reacción de la siguiente manera:
- Para 1 reacción:
- Regulador Minus —– 10X 2.5 µL
- MgCl2 50 mM —– 0.75 µL
- Oligo sentido —– 1 µL
- Oligo antisentido —– 1 µL
- dNTP’s —– 0.5 µL
- Taq Polimerasa —– 0.1 µL
- Agua de ampolleta estéril —– 18.5 µL
- ADN templado —– 1 µL
- Volumen total de reacción —– 25 µL
- Para 1 reacción:
Esto es para una sola reacción, dependiendo del número de reacciones a realizar. Lo que se hace es preparar una mezcla madre de reacción en la cual se adicionan todos los reactivos excepto los oligos y la muestra de ADN. Una vez preparada la mezcla madre, esta se coloca en los diferentes tubos de reacción y posteriormente a cada tubo se le adicionan los oligos y la muestra de ADN. Si en todas las reacciones se van a utilizar los mismos oligos, estos se pueden adicionar a la mezcla madre. El objetivo de preparar una mezcla madre de reacción es el de disminuir el riesgo de contaminación y el error por pipeteo. No te debes de olvidar de incluir siempre un control negativo y un control positivo de amplificación. Esto es para verificar que la amplificación obtenida sea exclusivamente debida a la muestra y no a que exista algún tipo de contaminación.
- Una vez preparados los tubos estos se colocan en el termociclador.
- Se programan las condiciones de reacción con base en las características de la muestra y de las temperaturas de alineamiento de los oligos. Se programan en el equipo las diferentes etapas de la reacción junto con sus temperaturas y tiempos. Se muestra un ejemplo de las condiciones de amplificación para una reacción en general:
- Desnaturalización inicial: 94 °C por 4 min
- 30 ciclos:
- Desnaturalización 94 °C por 1 min,
- Alineamiento: La temperatura y tiempo dependerá de los oligos que se utilicen.
- Extensión 72 °C por 1 min
- Extensión final: 72 °C por 7 min.
Cabe mencionar que estas condiciones pueden cambiar, dependiendo de las características de los oligos y de la muestra de ADN.
- Una vez terminado el proceso de amplificación, las diferentes muestras son analizadas por electroforesis en un gel de agarosa para verificar si hubo amplificación o no y si el tamaño del fragmento amplificado es el esperado.
Conclusión
En conclusión, en esta clase pudiste practicar la realización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica de utilidad en la amplificación de fragmentos de ADN. Actualmente es una técnica que posee gran cantidad de aplicaciones por lo que es necesario conocerla. Durante la clase te has dado cuenta de la importancia de las condiciones necesarias para esta técnica de acuerdo con los reactivos utilizados en la misma además de que también se requiere realizar una manipulación correcta de las micropipetas puesto que se utilizan volúmenes muy pequeños para estas reacciones.
Hemos concluido la clase y como puedes notar has avanzado mucho durante el trayecto del curso ¡Muchas felicidades! Para que puedas alcanzar el aprendizaje esperado en esta clase te invito a repasar los temas y conceptos revisados, además realiza el reporte correspondiente y responde las preguntas incluidas en él, no te olvides de enviarlo antes de la fecha límite. Te encuentro en tu última clase.