Clase digital 16. Reacción en cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa

Introducción

¡Hola!

Es muy grato tenerte como estudiante en esta Unidad de Aprendizaje, para mi es un gran honor encontrarme con personas tan disciplinadas y comprometidas con su educación como lo eres tú ¡Te felicito!
Volviendo al tema de las clases, te invito a proseguir con esta nueva sesión número 16 titulada Reacción en cadena de la polimerasa de la UDA de Biología Molecular.

En esta clase veremos una de las técnicas más utilizadas en el laboratorio de Biología Molecular. Se trata de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica sirve para amplificar fragmentos de ADN y es una de las técnicas de rutina en el laboratorio. Además, es la que posee una gran cantidad de aplicaciones y su uso se ha incrementado considerablemente, debido a esto es de importancia conocer sus fundamentos. También se abordarán dos técnicas basadas en la PCR. Es importante que pongas especial atención a los conceptos teóricos presentados ya que te serán de utilidad en la siguiente sesión práctica.

En este contexto, ¡Comencemos nuestra clase!

Desarrollo del tema

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es, la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una sola molécula. Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary Mullis debido a la necesidad de obtener, de manera rápida y económica, un gran número de copias de fragmentos específicos de ADN. La amplificación se basa en el mecanismo de replicación del ADN que lleva a cabo la célula, por lo que se requiere de una cadena que sirva como molde y a partir de ella por complementariedad se van adicionando cada uno de los nucleótidos. La dirección en la que se lleva a cabo es la misma que durante la replicación de 5′ a 3′, ya que también requiere de un nucleótido con el grupo OH libre en el extremo 3′.

Los componentes de una reacción de PCR son los siguientes:

• ADN polimerasa. Es la que lleva a cabo la reacción de polimerización de la cadena de ADN, de forma similar a los que sucede durante el proceso de replicación del ADN. La que más se utiliza es la Taq polimerasa aislada de la bacteria Thermophilus aquaticus. Esta enzima es termoestable, incluso a temperaturas de 95°C.
• Magnesio. Requerido por la enzima para funcionar. Actúa como cofactor de la polimerasa.
• Oligonucleótidos. Es uno de los componentes más importantes de la reacción. Influyen en la eficiencia y especificidad de la reacción de amplificación. Se diseña un oligo sentido y uno antisentido, y se diseñan de tal forma que flanqueen la secuencia a amplificar. Se deben tomar en cuenta las siguientes características al momento de diseñarlos:
  • Composición de bases: contenido de G y C debe estar entre 40 a 60%
  • Longitud: Debe de ser entre 18 a 25 nucleótidos.
  • Evitar que existan secuencias complementarias en el oligo y que estos no sean complementarios entre sí.
  • La temperatura de alineamiento debe ser muy cercana o la misma para cada par de oligos. No debe de diferir en más de 5°C y se recomiendan temperaturas entre 50 a 65°C.
• Nucleótidos. Se tienen que adicionar los desoxirribonicleótidos trifosfatados (dNTPs) ya que con ellos se van a generar los fragmentos de ADN que se quieren amplificar. Se utilizan en concentraciones equimolares de cada uno de ellos.
• ADN molde. Es la molécula de ADN de la cual se va a amplificar el fragmento o fragmentos deseados. Funciona como molde para la amplificación.

La reacción se lleva a cabo en etapas y estas se repiten un determinado número de veces. Cada repetición se denomina ciclo de amplificación y generalmente se utilizan de 20 a 40 ciclos de amplificación. En cada ciclo la secuencia de interés se amplifica de manera exponencial (número de moléculas = 2 no. de ciclos). Las etapas de la reacción son las siguientes:

1. Desnaturalización. Al principio de la reacción se da una desnaturalización inicial la cual consiste en calentar la mezcla de reacción a 95°C por 10 min. Esto ocasiona que las dos cadenas del ADN molde se separen, se active la polimerasa y se desnaturalice cualquier contaminante que pudiera estar presente en la reacción. Una vez pasados los 10 min, se da otra etapa de desnaturalización, a la misma temperatura, pero un tiempo que va de 20 a 3o segundos.
2. Alineamiento. Una vez terminado el tiempo de la etapa de desnaturalización, lo que sigue es la etapa de alineamiento. En esta, los oligonucleótidos se alinean, por complementariedad de bases, a la secuencia de ADN molde y se unen a ella. La temperatura de esta etapa depende de las características de los oligos y el tiempo oscila entre los 20 y 40 segundos.
3. Extensión. Una vez unidos los oligos al ADN molde, viene la etapa de elongación. Es en esta etapa en donde actúa la ADN polimerasa. La enzima va adicionando cada uno de los nucleótidos, utilizando como plantilla cada una de las cadenas del ADN molde. Los oligos proporcionan el extremo OH libre que la enzima requiere para adicionar el siguiente nucleótido, recordando que las ADN polimerasa no pueden iniciar la síntesis desde cero. La temperatura en esta etapa es de 72°C y el tiempo va a depender de la longitud del fragmento a amplificar. Se utiliza un aproximado de 1 minuto por cada 1-1.5 kilobases. Terminado el tiempo de la etapa de elongación, el ciclo se vuelve a repetir, es decir, se vuelve a llevar a cabo la etapa de desnaturalización, alineamiento y extensión dependiendo el número de ciclos que se requieran. Terminada la etapa de elongación del último ciclo, se da una segunda etapa de elongación a la misma temperatura, pero por un tiempo más extenso. Lo anterior nos asegura que todos los fragmentos sean amplificados en su totalidad y que no queden incompletos. De esta manera termina la reacción.

Te invito a visualizar el siguiente video en donde se explica la técnica de PCR.

RT-PCR

La técnica de transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa es una de las aplicaciones de esta última. En esta técnica se parte de una muestra de ARNm o ARN total y se sintetiza ADN complementario de cadena sencilla. Es decir, se lleva a cabo la reacción inversa de la transcripción. Para ello se hace uso de una enzima denominada transcriptasa reversa, la cual se aisló por primera vez de un retrovirus. Una vez sintetizado el ADN complementario (ADNc), este se utiliza como molde para la amplificación por PCR. Esta técnica se utiliza para determinar la expresión de un gen, es decir, su transcripción.

Te invito a ver el siguiente video que trata sobre la técnica de RT-PCR

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real es una variante de la técnica de PCR convencional. En esta, la amplificación se monitorea en tiempo real utilizando técnicas de fluorescencia. Se inventó en 1996 por Higuchi y colaboradores. En esta técnica lo que se detecta es la fluorescencia emitida cada vez que se sintetiza un nuevo fragmento de ADN y tiene la sensibilidad suficiente para detectar una única molécula, permitiendo cuantificar el contenido de ADN en la muestra.

En la PCR tiempo real los fragmentos amplificados son pequeños y requiere que un compuesto fluorescente se una al fragmento formado y reporte su presencia. De esta manera, la señal detectada refleja la cantidad de producto formado. Durante los ciclos iniciales la señal es débil, pero conforme aumenta el número de ciclos, la señal se va incrementando.

Los compuestos que generan la fluorescencia son de dos tipos:

1. Sondas específicas: como la sonda Taqman.
2. Colorantes no específicos como el SYBR green, que solo da fluorescencia cuando se une al ADN de cadena doble.

En esta técnica la concentración relativa de nuestra secuencia de interés se obtiene interpolando todas las muestras en un punto umbral, ciclo de corte o Ct. Este ciclo se elige de tal manera que caiga dentro de la región exponencial de amplificación. A menor valor de Ct existe mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en una muestra. Con estos valores se puede cuantificar la cantidad de ADN que tenía nuestra muestra de interés. Es por ello que esta técnica también se conoce como PCR cuantitativo o qPCR.

Las etapas son las mismas que en un PCR convencional, lo único que cambia es el número de ciclos de amplificación, el cual es de aproximadamente 40 ciclos.

La técnica se puede acoplar a una reacción de transcripción reversa y utilizarse para cuantificar el nivel de expresión de un gen o un conjunto de genes en una muestra en particular.

Conclusión

En resumen, en esta clase se abordaron los principios y componentes de la técnica de PCR, la cual es una de las más utilizadas en el laboratorio de Biología Molecular. Actualmente muchos laboratorios la están utilizando como técnica de diagnóstico, sobre todo en pruebas moleculares, por lo que su uso se está incrementando cada vez más.

Hemos llegado al final de la sesión y me parece que vas sobre pasos muy seguros hacia el éxito. ¡Te felicito! No olvides la tarea asignada a esta clase, recuerda que es tu evidencia de aprendizaje, mándala como corresponde. Nos encontramos en la siguiente clase para poner en práctica lo aprendido esta vez.

Fuentes de información

• Salazar M.A.M., Sandoval R.A.S. y Almendáriz B.J.S. (2016). Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. (2a ed.). McGraw Hill