Extracción de ácidos nucleicos y proteínas
Introducción
¡Hola!
Es un gusto saber que continúas en este camino formativo, en esta ocasión nos encontramos en la clase 13 denominada Extracción de ácidos nucleicos y proteínas de la UDA de Biología Molecular.
Como habrás notado todos los temas van concatenados y uno prosigue al otro de manera consecutiva y gradual. Hemos rebasado la mitad del curso y hasta este momento ya se han abordado la mayoría de los conceptos teóricos por lo que llegó el momento de comenzar con el aspecto práctico, es decir, la aplicación de esos conceptos en las técnicas que se utilizan en el laboratorio. Pues bien, comenzaremos con dos de las técnicas que se utilizan mucho en la práctica debido a que son las que nos van a proporcionar el material de inicio. Me refiero a la extracción de ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN. Veremos algunos de los procedimientos más utilizados, así como el fundamento de los mismos, los reactivos y materiales que se emplean y las diferencias y similitudes entre las distintas metodologías.
De modo que, ¡Empecemos la clase!
Desarrollo del tema
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN deben aislarse del resto de los componentes celulares para su estudio. Dependiendo del tipo y el objeto del estudio se optará por extraer ADN o ARN. Por ejemplo, para estudios de expresión génica, se extraerá ARN mientras que para la búsqueda modificaciones o alteraciones génicas, se extraerá ADN.
La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de los estudios en biología molecular y para las técnicas del ADN recombinante que se verán más adelante. En la actualidad, se dispone de múltiples metodologías de extracción, lo que permite la selección de técnicas que más se ajusten al tipo de estudio que se está llevando a cabo. Algunos de los criterios que se utilizan para la selección de la técnica de extracción a utilizar son los siguientes:
- Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena sencilla, de cadena doble, plasmídico, genómico, ARN total, ARN mensajero o ARN ribosomal.
- Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotas o virus.
- Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido de una biopsia, sangre, suero, orina, tejido vegetal, cultivo bacteriano, fúngico, etc.
- Técnica en que se utilizará posteriormente el ácido nucleico extraído (PCR, secuenciación, RT-PCR, etc).
Las técnicas comunes de extracción de ácidos nucleicos son muy diversas e incluyen procesamientos químicos y físicos que las diferencian. Aquí se abordará la técnica de fenol cloroformo para ejemplificar los pasos generales del proceso de extracción.
Extracción de ADN por la técnica de Fenol- cloroformo
Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al ADN puro listo para su separación por precipitación en soluciones alcohólicas. Es la técnica más empleada, por la cantidad y la calidad del ADN obtenido. Los pasos que se llevan a cabo son los siguientes:
Lisis celular
El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes (Triton o dodecil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las membranas celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido nucleico.
Extracción de proteínas y lípidos
Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purificación. Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una solución que tiene una relación 25:24:1 v/v para el fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. El alcohol isoamílico se emplea para reducir la espuma que puede generarse al agitar esta solución. La función de esta solución es la desnaturalización de las proteínas (entre ellas las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la centrifugación de la muestra. El ADN es poco soluble en fenol, por lo que previamente suele estabilizarse con una solución amortiguadora de Tris que lo mantiene en un pH de 8.0 a 8.5, lo que hace que el ADN permanezca en la fase acuosa.
Precipitación de ADN
El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), debido a que es insoluble en soluciones alcohólicas. La precipitación se favorece incubando a bajas temperaturas (–20°C); una centrifugación posterior permite la obtención de una pastilla en el fondo del tubo.
Lavado del ADN
La pastilla obtenida se lava con etanol al 70%. Después del lavado, se seca la pastilla permitiendo que se evapore el alcohol. Por último, la pastilla de ADN se disuelve en agua estéril libre de DNAsas o bien en alguna solución amortiguadora como el Tris-EDTA. También se pueden adicionar RNAsas para degradar el ARN que haya podido quedar después de la extracción.
Te invito a visualizar el siguiente recurso titulado DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis donde se aborda la extracción de ADN.
Extracción de ARN
Al realizar la extracción de ARN existen dos posibilidades: extracción de ARN total (ARNm, ARNr y ARN de transferencia, ARNt) y extracción oclusiva de ARNm. Es menos complejo y generalmente más barato la extracción de ARN total, y a menos que el ARNm sea sumamente escaso se opta por esta opción. El ARN total se puede extraer utilizando la técnica de fenol-cloroformo, con algunas modificaciones. La principal es en la etapa de lisis en la cual se utilizan el isotiocianato de guanidina y el fenol. El isotiocianato de guanidina es un potente desnaturalizante de proteínas con capacidad de inhibir RNAsas. El fenol y el cloroformo se utilizan en la extracción del ARN con los mismos fines que en la extracción del ADN. La diferencia radica en que la solución de fenol utilizada en la extracción de ARN tiene un pH entre 5 y 6 para favorecer su extracción. De esta manera el ARN es retenido en la fase acuosa y el ADN en la fase orgánica. Posteriormente, el ARN es purificado a partir de la fase acuosa mediante precipitación a baja temperatura con isopropanol y con ayuda de una centrifugación de manera similar a como se hace con ADN.
Conclusión
En resumen, la extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de los estudios en biología molecular y para las técnicas del ADN recombinante, existen múltiples metodologías de extracción. Para la selección de la técnica de extracción se toman en cuenta criterios como tipo de ácido nucleico que se va a extraer, organismo origen del ácido nucleico, fuente del ácido nucleico y técnica en que se utilizará posteriormente el ácido nucleico extraído.
En esta clase se abordó una de las técnicas para la extracción tanto de ADN como de ARN: la técnica de fenol-cloroformo. Esta técnica de extracción es muy utilizada en los laboratorios de biología molecular. En el caso de la extracción de ADN se realizan los siguientes pasos generales: homogeneización del tejido y lisis celular con el uso de detergentes; seguido de la extracción de proteínas y lípidos utilizando una solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico en una relación 25:24:1 v/v, el fenol utilizado tiene en un pH de 8.0 a 8.5. El ADN es poco soluble en fenol debido a esto permanece en la fase acuosa para posteriormente ser precipitado con alcohol absoluto e incubación a baja temperatura, de aquí el ADN se recupera por centrifugación. Finalmente se lava con etanol al 70%. Una vez seca la pastilla se disuelve en agua estéril libre de DNAsas o en alguna solución amortiguadora como el Tris-EDTA.
Para la extracción de ARN se puede utilizar la misma técnica con algunas modificaciones, la principal es en la etapa de lisis en la cual se utilizan el isotiocianato de guanidina y el fenol, además de que la solución de fenol utilizada en la extracción de ARN tiene un pH entre 5 y 6 para favorecer su extracción. Posteriormente, el ARN es purificado a partir de la fase acuosa mediante precipitación a baja temperatura con isopropanol y con ayuda de una centrifugación de manera similar a como se hace con ADN.
Hemos llegado al final de la clase ¡Te felicito por tu logro! Para completar la sesión te pido que realices la tarea asignada. Sigue avanzando en tu curso, falta poco para que logres completarlo. Te espero en la siguiente clase, hasta luego.
Fuentes de información
- Salazar M.A.M., Sandoval R.A.S. y Almendáriz B.J.S. (2016). Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. (2a ed.). McGraw Hill