Tecnología del ADN recombinante
Introducción
¡Hola!
Qué gusto encontrarte nuevamente en esta Unidad de Aprendizaje, te doy la bienvenida a la clase 14 titulada Tecnología del ADN recombinante de la UDA Biología Molecular. Debo decirte que es muy satisfactorio saber que sigues vigente en tu proceso formativo, te invito a que continúes en él.
En esta clase abordaremos lo que se conoce como Tecnología del ADN recombinante. La cuál es una tecnología que utiliza enzimas para cortar y unir secuencias de ADN de interés que pueden provenir de diferentes organismos. Las secuencias de ADN recombinado se colocan en unos vehículos llamados vectores que transportan el ADN hacia el lugar adecuado de la célula hospedera donde puede ser copiado (clonado) o expresado.
Por lo tanto, la tecnología del ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.
Una vez mencionado lo anterior, ¡Iniciemos la clase!
Desarrollo del tema
Como se mencionó anteriormente, la tecnología del ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. Las etapas son las siguientes:
- Obtención del fragmento de ADN de interés: en este caso se trata del gen de interés que se quiere expresar o clonar. El fragmento de interés se puede obtener de dos maneras, la primera es mediante el uso de enzimas de restricción y la segunda mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En esta clase abordaremos el primer método debido a que en la siguiente clase teórica se abordará la PCR.
Las enzimas de restricción son endonucleasas que poseen la habilidad de cortar las cadenas de ADN en una secuencia específica. Las enzimas de restricción pertenecen a las endonucleasas del tipo II las cuales se caracterizan por realizar el corte de manera específica, es decir, reconocen una secuencia y es en esa en donde realizan el corte. El sitio de reconocimiento para estas enzimas es una secuencia palindrómica (tiene la misma secuencia si se lee en un sentido que en el otro) y cada enzima reconoce su propia secuencia. Una vez reconocida realiza el corte de las dos cadenas.
Las enzimas de restricción pueden generar dos tipos de extremos al momento de realizar el corte. Pueden generar extremos cohesivos (pegajosos) o extremos romos (rasurados) (Imagen 2). Actualmente existe una gran variedad de enzimas de restricción, por lo que el uso determinado de alguna de ellas dependerá de las características de esta y del objetivo del estudio.
Tomado de Salazar M.A.M., Sandoval R.A.S. y Almendáriz B.J.S. (2016).
- Unión a un vector: Obtención de DNA recombinante: Una vez generado el fragmento por cualquiera de las técnicas mencionadas, el siguiente paso es ligarlo en un vector. El cual servirá de vehículo para almacenar y transportar nuestro fragmento de interés. Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena, con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno. Los vectores se clasifican en vectores de clonación y vectores de expresión. Los primeros se utilizan como una forma de almacenamiento de secuencias y para la obtención de grandes cantidades del fragmento insertado. Los segundos se utilizan para expresar el gen de interés en el organismo diana, es decir, su función es la de permitir la transcripción del fragmento de ADN insertado. Los vectores de ambos tipos suelen ser plásmidos, fagos y cromosomas artificiales de bacteria y de levadura.
Los plásmidos son pequeñas moléculas ADN circular de cadena doble. Se replican y se transmiten con independencia del cromosoma bacteriano. Son los más utilizados.
Los fagos son derivados de los bacteriófagos, virus que infectan bacterias. Al igual que los plásmidos, los bacteriófagos se replican de forma autónoma. Para convertirlo en un vector, se han modificado genéticamente eliminando los genes que no se requieren para la replicación e incorporando los elementos básicos de un vector (verlo más adelante). El bacteriófago lambda es el fago más utilizado como vector.
Los cromosomas artificiales son fragmentos de ADN de mayor tamaño pueden ser de bacterias (BAC) o de levadura (YAC). Se replican como un cromosoma independiente dentro de la célula. Este tipo de vectores son particularmente útiles para clonar fragmentos de gran tamaño, pueden clonarse en cromosomas artificiales de bacterias. Los YAC son cromosomas artificiales que contienen telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador de selección para su identificación en las células que los contengan.
Los vectores, ya sean de clonación o de expresión, poseen tres elementos indispensables:
- Origen de replicación: Es necesario para que el vector se replique en la célula. La mayoría de los vectores tienen el origen de replicación para bacterias (E. coli) lo que permite que la célula haga múltiples copias del vector y por lo tanto de nuestro fragmento de interés.
- Marcador de selección: Este elemento permite seleccionar las células que recibieron el vector de las que no lo hicieron. Los que más se utilizan son los de resistencia a antibióticos, es decir, el vector le va a permitir a la bacteria crecer en un medio con antibiótico. De esta manera se puede hacer la selección de las células que tienen el vector de las que no lo tienen. Únicamente las que tienen el vector serán capaces de crecer en un medio con antibiótico.
- Sitio de clonación múltiple: Es la región en donde se localizan las secuencias para diferentes enzimas de restricción. Nos va a permitir cortar el vector e insertar nuestro fragmento de interés. Es el sitio en donde se inserta el fragmento.
Estos tres elementos están presentes en todos los vectores de clonación. Los vectores de expresión, a parte de estos elementos, también poseen los elementos necesarios para que se de la expresión del fragmento. Los diferentes elementos presentes van a depender del organismo para el cual el vector fue diseñado. Por ejemplo, un vector de expresión eucariota requiere la presencia de una secuencia promotora eucariota y de una secuencia de poliadenilación para que la expresión del fragmento se lleve a cabo correctamente. Algunos vectores de expresión además incluyen las secuencias de reconocimiento para el ribosoma y etiquetas que facilitan la recuperación del producto del gen de interés. Los diferentes elementos presentes en cada tipo de vector se muestran en la imagen 4.
- Introducción en una célula hospedera: Existen varios métodos para introducir el vector con el fragmento de interés a la célula objetivo. El método a elegir dependerá del tipo de célula u organismo en el cual se va a introducir el vector. Para bacterias los más utilizados son el de shock térmico y la electroporación. Este último se utiliza en una gran variedad de células además de las bacterianas. Visualiza los siguientes videos donde se explica cada uno de estos dos métodos.
Shock térmico
- Identificación de colonias que contienen el DNA recombinante de interés: Para la identificación de las colonias que contienen en fragmento de interés se utilizan los marcadores de selección. Para ello las bacterias transformadas se ponen a crecer en un medio selectivo de tal manera que las células que logren sobrevivir en ese medio son las que tienen el vector. Hay algunos vectores que incluso permiten seleccionar las células que tienen el vector y que además tienen el inserto de interés. Un ejemplo de esto es la selección que se conoce como blanca/azul. En esta, el vector tiene en su estructura el gen lacZ, el cual codifica para la enzima beta galactosidasa encargada de degradar la galactosa. Este gen se encuentra ubicado justo en el sitio donde se inserta el fragmento, de tal manera que al insertarse este, el gen lacZ queda interrumpido y no se expresa. En caso de que el fragmento no se inserte en el vector, lacZ no se interrumpe y se expresa de forma correcta. Para realizar la selección lo que se hace es adicionar al medio un compuesto llamado X-gal, que es un análogo a la galactosa y cuyo metabolismo genera un producto de color azul. Por lo tanto, las colonias de las células que expresan lacZ se tiñen de azul y las que no se quedan blancas. Así, las colonias azules tienen el vector, pero no el inserto y las blancas tienen tanto el vector como el inserto de interés.
Te invito a visualizar el siguiente video que resume cada uno de lo pasos vistos en la clase.
Conclusión
Para concluir esta sesión repasemos lo siguiente: en esta clase abordamos lo que se conoce como la tecnología del ADN recombinante, la cual nos permite aislar un gen de un organismo y expresarlo en otro completamente diferente. Cuando se introduce un ADN recombinado en algún organismo, ocurre una modificación genética que se traduce en un cambio de rasgos ya existentes o en la expresión de rasgos nuevos. El desarrollo de esta tecnología ha permitido grandes avances en áreas como la medicina, la agricultura, la farmacología, etc.
Se mencionó que los 3 elementos que debe tener un vector son: origen de replicación, marcador de selección y sitio de clonación múltiple. También se describieron los diferentes tipos de vectores y las características de cada uno de ellos. Por último, vimos las etapas para generar una molécula de ADN recombinante así como su introducción a la célula objetivo.
Es así como llegamos al término de esta clase. Espero que la información expuesta te permita enriquecer tu conocimiento. Para finalizar la clase debes hacer la actividad correspondiente. ¡Vas muy bien, ya casi terminas este trayecto formativo felicidades! Te espero en la siguiente clase.
Fuentes de información
- Salazar M.A.M., Sandoval R.A.S. y Almendáriz B.J.S. (2016). Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. (2a ed.). McGraw Hill
- Lodish H. et al. (2016). Molecular Cell Biology, (8a ed.). W.H. Freeman and Company